LY∕T 3267-2021 白蜡属品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(林业)
|
ID： |
1A1A6FE9A273481E9CEAAD8EBC3E1622 |
|
文件大小(MB)： |
0.39 |
|
页数： |
13 |
|
文件格式： |
|
|
日期： |
2021-12-23 |
|
购买： |
文本摘录（文本识别可能有误，但文件阅览显示及打印正常，pdf文件可进行文字搜索定位）：
ICSICSICS,65.020,CCS CCS CCS,B,中华人民共和国林业行业标准,LY/T XXXXX—XXXX,LY,白蜡属品种鉴定技术规程 SSR分子标记法,Technical regulations for the identification of Fraxinus cultivars—SSR marker method,(点击此处添加与国际标准一致性程度的标识),（报批稿）,2019-11,在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上,XXXX - XX - XX发布,XXXX - XX - XX实施,国家林业和草原局 发布,LY/T XXXXX—XXXX,II,前言,本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任,本文件由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC 115）归口,本文件起草单位：山东省林业科学研究院、山东省林木种苗和花卉站、山东农业大学、山东华博基因工程有限公司,本文件主要起草人：燕丽萍、吴德军、王因花、刘翠兰、李丽、臧真荣、李善文、王开芳、姚俊修、任飞、李庆华、周继磊、李际红,LY/T XXXXX—XXXX,1,白蜡属品种鉴定技术规程 白蜡属品种鉴定技术规程 白蜡属品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 分子标记法,1 范围,本文件确立了利用SSR指纹图谱对白蜡属品种鉴定的程序,本文件适用于以白蜡属（Fraxinus）品种幼嫩组织（叶片，芽等）为材料，利用SSR指纹图谱对白蜡属品种的鉴定,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,LY/T 2745 仁用杏品种鉴定技术规程 SSR分子标记法,3 术语和定义,LY/T 2745界定的以及下列术语和定义适用于本文件,3.1,待检品种 test cultivar,待鉴定的白蜡属品种，由送检人提供,3.2,简单重复序列 simple sequence repeats,基因组中由1个至6个核苷酸组成的DNA串联重复序列，简称SSR,3.3,基因型频率 genotype frequency,群体中某一位点特定基因型个体数占全部个体数的百分比,4 原理,本文件选用通过转录组测序获得的17对高度多态性的EST-SSR引物，用于白蜡属品种的遗传鉴定。在检测过程中，采用真实品种的DNA模板做为对照品种，从待检苗木中抽样做为待检品种。利用SSR引物进行扩增，将待测品种与对照品种的SSR指纹对比结果进行分析，若待检品种与对照品种在任一引物扩增位点上基因型不同，则可判定待检品种与标准品种不是同一品种。当不同引物扩增位点上基因型都相同时，可根据标准样品在不同位点上的基因型频率乘积，计算出待检品种与对照品种是同一品种的概率,5 主要仪器和设备,仪器设备见附录A,LY/T XXXXX—XXXX,2,6 试剂与溶液,主要试剂与溶液配置方法见附录B,7 操作程序,7.1 样品,选用白蜡属不同品种幼嫩叶片、嫩芽等组织0.2 g，提取基因组DNA。本文件选用已通过国外和国内审（认）定的白蜡优良品种，见附录C,7.2 DNA的提取、纯化及定量,7.2.1 CTAB法提取DNA,CTAB法提取DNA的步骤如下,a) 将配制好的CTAB 提取缓冲液置于65 ℃的水浴锅中预热30 min，氯仿:异戊醇 (24:1 )、无水乙醇、70%乙醇置于-20 ℃冰箱预冷备用，研钵需提前预冷，使用前再用少量液氮预冷,b) 取0.4 g～0.5 g白蜡幼叶，搁置于研砵中，加入约30 mL的液氮研磨至粉末状，迅速转入2 mL离心管中，加入600 μL 2%的CTAB 提取液（含2%β-巯基乙醇），充分混匀。在65 ℃的水浴锅中水浴30 min，其间轻轻颠倒3～4次,c) 冷至室温后加入600 μL的氯仿：异戊醇(24：1)抽提10 min，其间不停地轻轻地摇动，冷却至室温，在12 000 r/min 离心10 min,d) 将上清液（约500 μL）转入另一离心管中，加等体积氯仿：异戊醇 (24:1)重复步骤c),e) 取出上清液并移到另一个干净的1.5 mL的离心管中，再加0.7体积的异丙醇并颠倒混匀沉淀DNA，出现絮状DNA，-20 ℃放置1 h，观察沉淀生成,f) 8000 rmp室温离心5 min，倒掉上清液，沉淀用1 mL75%的酒精洗涤两次，超净工作台静置乙醇挥发干净,g) 待DNA风干后( DNA不宜过分干燥，否则极难溶解 )，用50 μl的TE pH 8.0或超纯水溶解，4 ℃放置6 h～12 h使其充分溶解,h) 加入2 μL RNA酶10 mg/mL，37 ℃水浴1 h,i) 等体积苯酚-氯仿-异戊醇去蛋白一次，氯仿-异戊醇去蛋白一次，上层水相中加入1/10体积的3 M NaAc，两倍体积的无水乙醇，混匀-20 ℃放置1到2 h，离心，干燥DNA，溶于30 μL TE中；-80 ℃ 保存备用,7.2.2 DNA定量和质量检测,DNA定量和质量检测的步骤如下,a) 取2 μLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，可以直接读出DNA浓度和A260/A280的比值，比值在1.8～2.0之间符合要求,b) 另取取3 μL DNA加等体积0.2‰的溴酚蓝，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳15 min～20 min，稳压100 V，电泳缓冲液为1×T……
……